FDA批准的NGS肿瘤检测产品技术内容深度解读

2017-11-23 947次

2017年11月16日,美国食品和药物管理局(FDA)宣布批准MSK-IMPACT™产品用于多肿瘤的多基因检测。此产品由纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSK)研发,采用二代测序(NGS)的方法检测肿瘤的468基因突变及其他分子变化。这是FDA首次针对NGS癌症大panel基因检测的审批,为今后NGS产品的审批铺平了道路。


云健康小编参考57页MSK-IMPACT™产品英文审批材料,从数据分析、对照、结果报告和性能这几方面为大家具体介绍此产品。

 


MSK-IMPACT™产品概述



 

检测对象:肿瘤患者的FFPE包埋的实体恶性肿瘤组织及相对应的正常组织

检测内容:从468个基因的6284个外显子中检测体细胞突变(SNV)、小的插入缺失(Indel)和微卫星不稳定性(MSI) 

检测方法:二代测序(NGS),基于Illumina HiSeq 2500 测序仪平台




数据分析





当样本经过提取、建库、测序就到了数据分析,此步骤包括数据管理系统对数据的管理、FASTQ文件的生产、Indexing QC检查、reads比对和BAM文件的生产、样本QC检查、突变分析、突变注释、MSI分析。在这里,我们详细看一下样本QC检查、突变分析和MSI分析这三块内容在本产品中是如何处理的。


  1.样本QC检查:     

这一步主要是通过SNP指纹图谱鉴定是否样本掺混(肿瘤和正常配对组织的不一致性应该为5%,不同患者之间的差异应该是25%左右)、是否样本与barcode污染、是否在正常组织中有肿瘤组织(如正常组织中是否存在BRAF V600E突变)。本产品的SNP指纹图谱探针覆盖大于1000 regions。


  2.体细胞突变的分析策略(mutation calling):     

本产品主要针对的是SNVs和Indels这两类的突变分析。分析流程包括去除低质量数据,假阳性和胚系突变。需要注意的是假如没有正常样本或者正常样本的测序平均深度<50X,那么是无法作为正常对照的,这时候需要与同批次混合的FFPE正常对照进行突变。

  1. 分析同批次混合的阳性和阴性对照样本:确定是否有污染和进行灵敏度分析。 

  2. 根据测序深度进行过滤:当样本测序深度≥100X时,检测变异频率≥10%的突变位点的灵敏度可达95%。为了能覆盖到98%的外显子区段,样本的平均深度需要≥200X。 

  3. 获取可信度高的突变:需要通过一系列分析获得可信度高的突变。分析过程的参数有:

         ●  证明是否为体细胞突变,如肿瘤组织与正常组织的突变频率比≥5.0, VFtumor:VFnormal≥5.0;

           是否为已知的突变热点;

           参考自建的假阳性数据库;

           过滤参数使用测序深度(DP),突变reads数(AD),突变频率(VF)。

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图一  具体过滤流程


 3.MSI的检测:   

采用program MSIsensor进行分析,具体内容请参考以下文献。

参考文献:Niu B, Ye K, Zhang Q, Lu C, Xie M, McLellan MD, et al. MSIsensor: microsatellite instability detection using paired tumor-normal sequence data. Bioinformatics (Oxford, England). 2014;30:1015.


对照




 对照包括相对应的正常组织的样本、阳性对照样本、阴性对照样本和PCR试剂空白(即无模板对照)。



结果报告




  1. 对于临床评估,本产品的报告分两类突变:“具有临床意义证据的癌症突变”和“具有潜在临床意义的癌症突变”,采用OncoKB进行证据等级评价。c

  2. 结果包括SNV和Indel这两类突变。

  3. 结果不包括73个外显子,因为其测序深度较低。

  4. 报告结果综合考虑了以下质量指标。


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图2  质量指标



性能



在对产品性能介绍中主要介绍了如何确定分析流程的各阈值、分析前性能表现、分析性能表现、临床评价表现等。由于篇幅有限,这里主要对分析性能这一块进行介绍:


 1.准确性研究:   

主要是评价不同run和同一个run的准确性。提取的DNA每天跑一次,跑三天,用不同的barcodes。在同一run中,一个样本跑三次,共3+1+1次重复。 采用已知肿瘤类型和突变的10个样本(9个FFPE和1个商业细胞株)以代表不同的肿瘤类型、不同的突变类型和突变等位基因频率,检测重复5次。结果显示在84个突变中,除了临床样本中的4个突变和商业细胞株中的3个突变不一样外,其它都完全吻合。

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 2.分析方法的灵敏度—检测限(LoD):   

本产品的LoD值是指95%的可能性此突变位点可以被检出。通过不同的稀释和5次重复来确定。


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图4  不同稀释后的分析结果

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图5  对不同的重复进行分析后的结果


 3. 线性范围: 

此项评价不适用本产品。

 4.可追溯性(控制,校准或方法): 

本产品无任何标准,空白和质量指标可见上文。

 5.稳定性: 

试剂稳定性依据的是生产厂商的有效期,通过对空白的使用进行监测。

 6.期望值: 

本流程对空白对照的使用遵循CLIA标准,虽然本产品不需要校准,但是我们会通过对混合空白对照对突变等位基因频率进行验证。

 7.分析特异性: 

需与空白对照一起测序分析

 8.界限值(cut-off值): 

本产品不报道小于2%的热点突变和小于5%的非热点突变。

 9.比较研究:

与其他已经验证的方法分析后的结果进行比较,如PCR法、IHC法等。




云健康实体瘤565基因个体化治疗解决方案


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云健康自主研发的565基因panel是基于高通量测序平台针对实体瘤相关基因进行检测的产品,可一次性同时检测突变、插入缺失、重排、拷贝数扩增及MSI结果,帮助医生进行靶向、免疫治疗、联合用药及化疗的选择。在panel设计方面,云健康565基因panel与MSK-IMPACT重合基因高达317个,并结合了中国患者的肿瘤突变信息,以及免疫通路相关基因,对565个基因全部外显子和部分内含子进行覆盖,并可对20条肿瘤相关信号通路进行分析和富集,从而指导信号通路垂直抑制和水平抑制的精准用药,对肿瘤突变负荷评估(TMB)进而预测免疫治疗效果,从而避免高昂的治疗费用和副作用负担。



编辑:阿星